原代心肌細(xì)胞研究要注意些什么？

　　作為主要的研究模型，原代心肌細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于心血管研究。那么我們?cè)谘芯窟^(guò)程中都要注意些什么呢？

　　1、新生鼠年齡的選擇新生鼠心肌細(xì)胞在出生后3天內(nèi)具有部分增殖能力，而成年鼠心肌細(xì)胞為終末分化細(xì)胞，不再具有分裂增殖能力。因此，大鼠出生時(shí)間越短，離體心肌細(xì)胞存活率越高，越容易貼壁。大量觀察表明，選擇1～3日齡大鼠分離心肌細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)是理想的，尤其是半日齡大鼠。

　　2、消化酶的選擇和使用

　　新生大鼠原代心肌細(xì)胞間可采用組織塊法和消化法分離。前者較少使用，因?yàn)殡y以獲得密度均勻的細(xì)胞和控制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)。消化法中常用的酶有3種：胰蛋白酶、膠原酶I或II和透明質(zhì)酸酶。透明質(zhì)酸酶主要與胰蛋白酶或膠原酶結(jié)合使用。胰蛋白酶作用強(qiáng)，容易對(duì)心肌細(xì)胞造成損傷。膠原酶作用溫和，能消化細(xì)胞間質(zhì)中的膠原纖維，釋放細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞損傷小。在新生大鼠的心肌組織中，膠原酶Ⅰ主要是膠原Ⅰ。文獻(xiàn)報(bào)道膠原酶的工作濃度一般為0.6～1G·L1，我們采用0.8g·L1。現(xiàn)在最好用膠原酶。

　　3、掌握消化程度

　　新生大鼠心肌細(xì)胞對(duì)酶消化非常敏感，過(guò)度消化會(huì)導(dǎo)致肌原纖維，增加細(xì)胞死亡率或失去粘附和搏動(dòng)性；由于消化不充分，細(xì)胞聚集成簇，難以區(qū)分細(xì)胞邊界和形態(tài)觀察。在消解過(guò)程中使用磁力攪拌器時(shí)，應(yīng)注意1）轉(zhuǎn)速一般控制在60～80R·Min1左右。(2)每次消化的時(shí)間必須結(jié)合消化酶的濃度來(lái)確定。(3)吹走粘附在攪拌器上的心肌組織，使酶液充分接觸組織。(4)適宜的溫度為35～37℃(5)當(dāng)組織由紅變白并呈半透明狀時(shí)，應(yīng)停止消化。

　　4、接種細(xì)胞密度

　　原代心肌細(xì)胞間的接種密度不僅影響細(xì)胞間的相互接觸，從而影響細(xì)胞對(duì)肥大刺激的反應(yīng)，而且影響長(zhǎng)期培養(yǎng)細(xì)胞的存活率。應(yīng)準(zhǔn)確計(jì)算接種細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)。一般來(lái)說(shuō)，單位面積的細(xì)胞數(shù)應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的觀察目的來(lái)確定。